Biologia Molecular Pratica I

1. INTRODUÇÃO

Os estudos detalhados da estrutura e função de um gene em nível molecular exigem grande quantidade de determinado gene em uma forma pura. Muitas técnicas freqüentemente são referidas como tecnologia do DNA recombinante, que compreende uma mistura de técnicas, algumas novas e outras adotadas de outros campos, como de genética microbiana. Dentre essas técnicas estão às seguintes técnicas-chaves: clivagem de DNA em sítios específicos por meio de nucleases de restrição, que facilitarão muito o isolamento e a manipulação de genes individuais; clonagem de DNA com uso de vetores de clonagem, ou pela reação em cadeia pela polimerase, pela qual uma única molécula de DNA pode ser copiada para gerar varias bilhões de moléculas idênticas; hibridização de ácidos nucléicos, que torna possível encontrar uma seqüência especifica de DNA ou RNA com grande precisão e sensibilidade, com base em sua habilidade de se ligar a uma seqüência complementar de ácidos nucléicos; seqüenciamento rápido de todos os ácidos nucléicos de um fragmento de DNA purificado, que torna possível identificar genes e deduzir a seqüência de aminoácidos da proteína que ele codifica; monitoramento simultâneo do nível de expressão de cada gene em uma célula, utilizando microarranjos e de ácidos nucléicos, que permite que dezenas de milhares de reações de hibridização seja realizadas simultaneamente.
O principal objetivo da clonagem do DNA é obter pequenas regiões definidas do DNA de um organismo, que constituem genes específicos. Além disso, somente moléculas de DNA relativamente pequenas podem ser clonadas nos vetores disponíveis. Por isso, as moléculas de DNA muito longas que compõem o genoma de um organismo devem ser clivadas em pequenos fragmentos que possam ser inseridos nos vetores de DNA. Dois tipos de enzimas, as enzimas de restrição e as DNAs ligases, facilitam a produção de tais moléculas de DNA recombinantes.
As enzimas de restrição são endonucleases produzidas por bactérias que