Atividade de mieloperoxidase e produção de oxigênio singlete em leucócitos

ÍNDICE
1 Introdução 8 1.1 Leucócitos Polimorfonucleares e Mononucleares 9 1.2 Sistema NADPH oxidase 11 1.3 Mieloperoxidase 13 1.4 Formação de oxigênio singlete 14
2 Objetivos 18 2.1 Objetivo geral: 18 2.2 Objetivos específicos: 19
3 Protocolo Experimental 19 3.1 Casuística 19 3.2 Critérios de exclusão 20 3.3 Preparação de estímulos 20 PMA: 21 3.4 Isolamento de neutrófilos humanos de sangue periférico 21 3.5 Isolamento de células mononucleares e monócitos humanos de sangue periférico 22 3.6 Quimiluminescência amplificada por luminol e lucigenina (“Burst” oxidativo) 23 3.7 Utilização do 9,10-difenilantraceno (DPA) como captador químico de 1O2 24 3.8 Detecção indireta de 1O2 em fagócitos: macrófagos, células dendríticas e neutrófilos através do captador químico ABPE 24 3.9 Obtenção de imagens por microscopia confocal 26 3.10 Imunofenotipagem de linfócitos humanos por citometria de fluxo (FACS) 26
4 Resultados e discussão 28 4.1 Detecção de 1O2 em fagócitos através do captador químico 9,10-difenilantraceno (DPA) 28 Formação dos padrões de DPA e seu endoperóxido DPAO2, marcação de ZO com DPA e avaliação de eficiência de extração: 28 4.2 Tentativa de avaliação da produção de 1O2 em leucócitos através da oxidação do DPA adsorvido em ZO e monitorado por HPLC 30 4.3 Monitorização da produção de 1O2 em neutrófilos, monócitos e por microscopia confocal e quimiluminescência 36 4.4 Detecção de 1O2 através da sonda ABPE 45 4.5 Determinação de MPO em linfócitos 50
5 Conclusões 54
6 Referências 56

lISTA DE ABREVIATURAS
ABPE – éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila
ACN – acetonitrila
DC – células dendríticas
DPA – 9,10-difenilantraceno
ERO – espécies reativa de oxigênio
H2O – água
H2O2 – peróxido de hidrogênio
HOCL – ácido hopocloroso
HPLC – high performance liquid chromatograpphyt (cromatografia líquida de
IFN - γ - Interferon gama -