Técnicas em biomol

Técnicas em Biologia Molecular DNA recombinante; enzimas de restrição; clonagem gênica; sequenciamento; PCR; aplicações médicas

DNA recombinante: o que é?
• É uma molécula de DNA gerada pela união de dois pedaços DNA que não se encontram associados normalmente, em geral derivados de organismos diferentes.

DNA recombinante: para que serve
• Isolar um gene de interesse de estudo para conhcer sua sequência ou para expressar seu produto para fins de pesquisa ou biotecnológico • Ex: insulina, hormônio de crescimento, vacinas

Como começou esta tecnologia
• 1953: DNA de uma cepa de E.coli (B), quando introduzido em outra cepa de E.coli (C), era rapidamente clivado em pequenos fragmentos. O mesmo ocorria com DNA de vírus (bacteriófagos) que não infectam normalmente a cepa C. • Extratos de E. coli (C) quebravam moléculas de DNA de diversas origens, mas não o DNA de suas células. E no caso de alguns vírus, o DNA não era clivado, e o vírus era capaz de se replicar na bactéria. • 1960s: análise de DNA viral que não era quebrado revelou várias modificações no DNA, não presentes em DNAs sensíveis a quebra.

Sistema metilação/restrição do DNA
• Diferença entre DNA clivado e DNA que não era clivado: • bases metiladas no DNA, não presentes em DNAs sensíveis • Cepas bacterianas possuem metilases que adicionam grupos metil – CH3 - às bases em sequências específicas do DNA este DNA era clivado este DNA não era clivado

Sistema metilação/restrição do DNA
• 1970s: uma nuclease foi purificada da bactéria Hemophilus influenza • A nuclease se ligava a moléculas de DNA em determinada sequência de bases, cortava o DNA dentro desta sequência (hidrolizava a ligação fosfodiester) gerando uma extremidade 5`fosfato e uma 3`OH, • mas não quebrava o DNA da própria bactéria, metilado na *A (*N6metiladenina)

Sistema metilação/restrição do DNA

• isoladas de diversas espécies e cepas bacterianas (milhares já isoladas) • enzimas cortam o DNA em sítios específicos de 4-8