Técnica pcr

Técnicas de PCR
PCR é uma técnica da biologia molecular que permite a replicação em vitro do DNA. Essa rápida amplificação de material genético permitiu uma melhor analise do DNA em investigações criminais (onde vestígios podem ser mínimos) e em diagnósticos médicos mais precisos de doenças.

O DNA é previamente cortado por enzimas de restrição, que limita a área a ser replicada. A replicação será mais limitada ainda pelos primers na segunda fase do PCR
Um exemplo é a enzima EcoR1 que reconhece a sequência de DNA GAATTC. Se esta enzima estiver atuando em um filamento de DNA, toda vez, que a enzima encontrar essa sequência ela corta o DNA entre G e A, produzindo fragmentos de restrição de DNA.

• Conclui-se que variações nas seqüências de DNA em sítios de restrição específicos produzem variações nos comprimentos dos fragmentos de DNA, que são separados por eletroforese em gel e visualizados com o uso de sondas conhecidas e marcadas, geralmente radioativamente.

O PCR consiste em três fases,que acontecem em um termociclador ,que controla automaticamente a temperatura do processo.

Primeiro passo: desnaturação, consiste na separação das fitas duplas. Com o aumento da temperatura as ligações de hidrogênio que une as duas fitas são quebradas. As ligações de hidrogênio são mais fracas que as ligações covalentes entre a pentose e o fosfato, que permanecem intactas.

Segundo passo: hibridização, objetivo do PCR não é replicar todo DNA, mas uma pequena seqüência de interesse. Os primers são seqüências sintéticas de nucleotídeos que se ligam a seqüência complementar na fita molde. São adicionados dois primers, um para cada fita simples. A temperatura é aumentada para que os primers possam se encaixar com a fita simples.

Terceiro passo extensão: pela ação da enzima Taq polimerase os nucleotídeos complementares a fita molde são adicionados da 5’ para 3’.A vantagem da taq polimerase é que ela trabalha a temperaturas altas sem ser desnaturada. E assim