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MÉTODO DE BRADFORD
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS

1) Reagentes:
 Comassie Blue G-250, H3PO4 e etanol;
 Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10 g/0,1mL).

2) Metodologia
 Preparação do reagente Comassie-blue G-250
Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L. Deixar overnight com agitação constante e filtrar. Dessa forma, as concentrações finais serão: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol. (Ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrário).

 Procedimento para obtenção da curva padrão
Proceder conforme Tabela 1. Após, agitar os tubos em vórtex e fazer a leitura no espectrofotômetro U.V. em = 595 nm.

Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão BSA (1 mg/mL).

Tubos BSA (1 mg / mL)
(mL) Água
(mL) Comassie Blue G-250
(mL) g proteína
1 0,00 0,10 5,0 0
2 0,02 0,08 5,0 20
3 0,04 0,06 5,0 40
4 0,06 0,04 5,0 60
5 0,08 0,02 5,0 80
6 0,10 0,00 5,0 100
* Volume reacional = 5,1 mL

Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alíquotas de 0,1mL retiradas de soluções de 20, 40, 60, 80 e 100 g de BSA/0,1mL. Se assim for, a curva seguirá o padrão mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão soluções diluídas de BSA.

Tubos BSA (X g / 0,1 mL)
(mL) Comassie Blue G-250
(mL) g proteína
1 0,1 de H2O 5,0 0
2 0,1 5,0 20
3 0,1 5,0 40
4 0,1 5,0 60
5 0,1 5,0 80
6 0,1 5,0 100
* Volume reacional = 5,1 mL

Obs 1: A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) que posteriormente deve ser centrifugado e o pellet ressuspendido com NaOH 0,1N. Após, retirar uma alíquota de 0,1mL e proceder conforme recomendações da curva padrão.