Tipos de Reaçao Polimerase

Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+.

Desnaturação

A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a cadeia dupla de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”.
Os dois filamentos ou cadeias de ADN são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas.

Hibridização
O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de ADN, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo.
Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleótidos, entre 20 e 30 bases.
Numa reacção de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de ADN que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de ADN alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência complementar.
Temperatura de annealing ou hibridização: normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade.

Extensão
Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de ADN, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de ADN.
A Taq polimerase é uma polimerase de ADN termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde