Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA recombinante
ICS – Ciências Biológicas
Disciplina: Biotecnologia e Bioinformática

Tecnologia do DNA recombinante déc. 70 conhecimento de mecanismos biomoleculares enzimas biológicas clivagem, ligação e síntese do DNA transcrição reversa do RNA

isolamento e purificação de ácidos nucleicos
CLONAGEM MOLECULAR

Tecnologia do DNA recombinante inserto + vetor

molécula de DNA recombinante
+
célula hospedeira

transformante

CLONAGEM MOLECULAR: isolamento e propagação de moléculas idênticas de DNA

Enzimas de restrição
1953 - mecanismos de defesa procariótica contra a infecção viral endonucleases de restrição

sítio de restrição

proteínas monoméricas ou diméricas reconhecimento e clivagem de uma sequência específica de DNA exógeno grupo metil

metilação do DNA endógeno

citosina

5-metilcitosina

Enzimas de restrição
1973: utilização in vitro sítios de restrição (região de reconhecimento): 4 a 8 pares de bases (pb) – geralmente 4 a 6 pares de bases simetria rotacional : sequências palindrômicas clivagens cegas ou abruptas

clivagens coesivas

Enzimas de restrição hidrólise da ligação fosfodiéster
3’ OH e 5’ fosfato

Enzimas de restrição (II) especificidade relevância do tamanho do sítio de restrição

Enzimas de restrição (II)
Sítio de restrição

Nome da enzima

Origem (organismo)

Extremidade

5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG 5’

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens H

coesiva

5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’

EcoRI

Escherichia coli RY13

coesiva

5’ GGCC 3’
3’ CCGG 5’

HaeIII

Haemophilus aegyptius

cega

5’ PuGCGCPi 3’
3’ Pi CGCG Pu 5’

HaeII

Haemophilus aegyptius

coesiva

5’ CTGCAG 3’
3’ GACGTC 5’

PstI

Providencia stuartii

coesiva

5’ CTCGAC 3’
3’ GAGCTC 5’

XhoI

Xanthomonas holcicola

coesiva

DNA ligase catalisa a reação: ligação fosfodiéster ligação do inserto em vetor previamente digerido por uma endonuclease de