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3.2. TÉCNICA E FUNDAMENTOS DA COLORAÇÃO DE GRAM Primeiramente deve-se confeccionar a lâmina, com a técnica do esfregaço, após a lâmina estar pronta, coloca-se a lâmina no suporte de lâmina para fazer a coloração: primeiro usa-se o gram 1 (Violeta Cristal) por 1 minuto, lava-se a lâmina em água, depois disso aplica-se o gram 2 (Lúgol, que é um fixador) por 1 minuto também, lava-se novamente a lâmina, aplica-se o gram 3 (Alcool-Cetona), lava-se de novo após 15 segundos e por ultimo, aplicamos o gram 4 (Fuscina Fenicada), após 30 segundos lava-se a lâmina por uma ultima vez. Seca-se a lâmina para retirada do excesso e a coloca em cima da caixa de fixação de material biológico.
Toda a coloração é baseada na espessura da parede celular bacteriana. As bactérias denominadas "Gram +" possuem parede espessa e homogênea, geralmente não estratificada e constituída principalmente por peptideoglicano enquanto as "Gram -" também possuem peptideoglicano na constituição de sua camada porém, essa é mais fina em relação as Gram +.Após a fixação do esfregaço, o cristal violeta é adicionado corando todas as bactérias (Gram + ou -) sem diferencia-las. A adição do lugol permite a fixação do cristal violeta no citoplasma devido a formação de complexos insolúveis.

Ao adicionar o solvente alcool-acetona a camada lipídica das bactérias Gram Negativo é destruída permitindo que na lavagem o complexo cristal violeta-lugol seja retirado, perdendo a coloração primária.

Por último temos a utilização de fuscina, responsável pela coloração avermelhada do citoplasma das Gram Negativas.

3.3. IMPORTANCIA DA COLORAÇÃO DE GRAM PARA DIAGNOSTICO CLINICO E TRATAMENTO EMPÍRICO