resumo purificaçao de DNA / eletroforese

BIOLOGIA MOLECULAR

Purificação de DNA:

1. Preparação de DNA celular total:

a) As células bacterianas são cultivadas = Os dois principais meios de cultura são M9 e LB (luria-bertani)

M9 = Meio de cultura definido no qual todos os componentes são conhecidos. Mistura de nutrientes inorgânicos para prover elementos essenciais como nitrogênio, magnésio e cálcio. Bem como glicose. (a definição dos elementos depende da espécie cultivada)

LB = É indefinido ou complexo, isso ocorre, pois em sua composição há triptona e extrato de levedura (que já são misturas complexas por si só). Esse meio não necessita de suplementação adicional e sustenta o desenvolvimento de variadas espécies.

OBS: O aumento do numero de células em cultura pode ser monitorado pela leitura da densidade óptica.

b) Preparação de um extrato celular = As células devem estar concentradas no menor volume possível , por isso culturas são sedimentadas por centrifugação . A centrifugação também separa as bactérias do meio de cultura
As barreiras celulares têm que ser rompidas (parede e membrana) e para seu rompimento existem métodos físicos e químicos
Os métodos químicos são mais comumente utilizados quando as células bacterianas devem ser lisadas visando à preparação do DNA (os agentes químicos dependem da bactéria)

LISOZIMA = Composto se apresenta na lagrima e na saliva capaz de digerir compostos poliméricos da parede celular.

EDTA = Remove íons de magnésio essenciais para a preservação da estrutura global do envoltório celular, alem de também inibir enzimas capazes de degradar DNA.

OBS: O enfraquecimento do envoltório celular com lisozima e edta normalmente é suficiente, mas se não for , também pode ser usado um detergente (geralmente SDS )

DETERGENTE = Auxiliam no processo de lise, removendo moléculas de lipídios, o que provoca o rompimento das células.

OBS: Depois de as células serem lizadas frações