Relat Rio Bioqu Mica 1

II. Objetivo Analisar o comportamento das enzimas em diferentes condições, como a concentração de substrato e a influência do inibidor.
III. Material e Método A. Material
Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5
Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5
Solução tampão tris-HCl 0,2 mM, pH 7,5, 8,5 e 9,5
Solução de NaOH 2M
Pipetador automático 20-200 μL
Pipetador automático 200-1000 μL
Pipetas de 1, 2 e 5 mL
Tubos de ensaio
Cubetas
Pró-pipete
Vortex
Espectrofotômetro

B. Método

1) Construção de uma curva padrão de PNP Foram transferidas alíquotas das soluções para os respectivos tubos de acordo com a tabela 1.

Tubo
Solução padrão de PNP (mL)
Tampão Tris-HCl, pH 9,5 (mL)
Solução de NaOH 2M (mL)
B

1

2

3

4

5

6

Tabela 1: Valores das alíquotas adicionadas em cada tubo na etapa 1

Após a adição das alíquotas, os tubos foram homogeneizados, e em seguida foi adicionado determinado volume de cada tubo em diferentes cubetas, de forma que elas fossem preenchidas até acima da metade de sua capacidade. Em seguida as cubetas foram levadas para realizar a sua leitura no espectrofotômetro, onde o tubo B foi considerado como o branco (referência).

2) Curva de substrato Foram transferidas alíquotas das soluções para os respectivos tubos de acordo com a tabela 2, menos as soluções de enzima e de NaOH.

Tubo
Tampão Tris-HCl pH 9,5 (mL)
PNPP 1mM (mL)
Enzima (mL)
Solução de NaOH (mL)
B

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Tabela 2: Valores das alíquotas adicionadas em cada tubo na etapa 2

Com o auxílio de uma pipeta automática, foi adicionado o volume de enzima em cada um dos tubos de forma contínua, mantendo o mesmo ritmo para cada um dos tubos. Os tubos foram homogeneizados e deixados reagindo por 10 minutos. Em seguida foi adicionado o volume de NaOH 2M em cada um dos tubos, mantendo o mesmo ritmo da primeira adição. Os tubos foram