Reação de polimerização em cadeia (pcr)

REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO
EM CADEIA (PCR)

PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA ou cDNA.

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho.

Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patentearam este processo.

Bactéria Thermus aquaticus
(Taq-polimerase).

PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR
A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do
DNA ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++
Ocorre
Ocorre em 3 etapas:
a) “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado),
b) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado),
c) “extension” (extensão ou seja a polimerização propriamente dita)

Replicação in vitro do DNA
Depende:
Alternância de temperaturas a cada ciclo:
• DESNATURAÇÃO
• ANELAMENTO
• POLIMERIZAÇÃO

Alternância de temperaturas a cada ciclo
1:Denaturaçao
94 ° C -96 ° C
Separa a fita dupla do DNA molde em duas fitas simples
2.Anelamento:
37 ° C -65 ° C
Primers se ligam aos sitios específicos na fita simples
3. Extensão: 72 °
DNA polymerase acrescenta os dNTPs à fita, de acordo com o pareamneto de bases

a)Desnaturação Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples.
Muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse.

b) AnelamentoA polimerase para anexar as