Protocolo biologia molecular

Protocolo
Foi utilizada uma cultura de bactérias E.coli inoculada na tarde do dia anterior ao experimento em meio de cultura líquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitação vigorosa a 37°C até a manhã do dia do experimento, quando a cultura foi transferida para a geladeira.
1. As bactérias foram coletadas através da centrifugação de 3mL da cultura a 5000rpm por 5 minutos. Descartou-se o meio de cultura em um frasco com Lisoform a 10%. O tubo foi seco e invertido sobre papel absorvente. Foi realizado o balanceamento dos tubos.
2. Foi adicionado 0,5mL da solução I (citrato de sódio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com HCl). O tubo foi tampado e o precipitado de bactérias ressuspendido por inversão.
3. A tampa foi removida e adicionou-se 2mL da solução II [Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 10% (P/V)]. O tubo foi fechado e incubado em banho-maria a 60°C por 10min sendo manualmente agitado suavemente.
4. O tubo foi retirado do banho, aberto e deixado em temperatura ambiente por 5 min. Adicionou-se igual volume (0,7mL) da solução III (Cloroformio: alcool isoamílico 24:1 V/V). O tubo foi muito bem fechado e agitado por 10 min a temperatura ambiente.
5. Centrifugou-se por 5 min a 3500rpm
6. A fase aquosa (fase superior) foi removida delicadamente com a pipeta, o volume foi calculado e transferido para outro microtubo.
7. Adicionou-se 3 volumes de etanol resfriado a -20°C, adicionado lentamente com a pipeta, escorrido lentamente pela parede do tudo.
8. O DNA foi retirado e ressuspendido em volume adequado de água destilada a 50°C até a completa dissolução.
Eletroforese de DNA em gel de agarose
Preparação do gel de agarose
1- Preparou-se uma solução de agarose em tampão TBE com concentração final de 1% (p/v). A mistura foi aquecida no microondas com agitação frequente até a completa dissolução da agarose.
2- Foi adicionado 1uL de brometo de etídeo para cada