PCR - Reação em cadeia da Polimerase

SENAI – CIC
ISABELLA DA SILVA BROCARDO
PATRICIA CAROLINE DE ARAUJO

RELATÓRIO

CURITIBA
2013
01)
- Em um micro tubo de ensaio, coloca-se uma solução tampão, os nucleotídeos, um cofator, dois primers (um negativo e um positivo), o DNA a ser analisado, água ultrapura e por último a DNA Polimerase, devido ao fato de ter que ser mantida em resfriamento.
- Coloca-se então o micro tubo em uma máquina de PCR, que realizara os ciclos de aquecimento e resfriamento.
- Aquece-se o tubo a 94ºC por 3 minutos para desnaturar o DNA.
- Cada fita serve de molde para síntese de novas cadeias complementares. Para que os primers se anelem e limitem a parte do DNA a ser multiplicado, ocorre um resfriamento a 59,5ºC.
- Após isso se aquece a 72ºC, temperatura ideal para o funcionamento da DNA Pol, para a duplicação da fita.
- Ocorrem então 30 ciclos (desnaturação – anelamento – alongamento).
- Após isso, a amostra é corrida em um gel de agarose, para analise.
02)
- Tm do primer BGH = 60ºC
Conteúdo de C = 16,66%
Conteúdo de G = 38,88 %
GC= 56% - Tm do primer FWD = 50 º C
Conteúdo de C = 27,77 %
Conteúdo de G = 11,11%
GC = 39%
Os primers são bem desenhados, pois, as porcentagens de GC estão dentro ou próximo do aceitável (56% e 39%), seus comprimentos estão dentro do ideal (18 nucleotídeos), não possuem auto complementariedade e não se complementam.
03)
Protocolo 01 = Está completo
Protocolo 02 = Falta o Primer + (nosso protocolo)
Protocolo 03 = Falta o Primer –
Protocolo 04 = Falta o tampão
Protocolo 05 = Falta MgCl2
Protocolo 06 = A temperatura de anelamento é muito elevada.
Protocolo 07 = A temperatura de anelamento é muito baixa.
Protocolo 08 = Está completo.
Protocolo 09 = Falta o primer +
04)
Protocolo 01 = Funcionou bem
Protocolo 02 ( nosso protocolo) = Devido a falta de um primer, ocorreu uma diminuição no rendimento da DNA pol, pois apenas uma das fitas estava funcionando. A DNA pol funcionou