Isolamento e cultura de protoplastos

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Protoplasto: Célula vegetal sem a parede
-1. Isolamento de protoplastos
Atualmente a obtenção de protoplastos é feita através de digestão enzimática da parede celular e existem vários protocolos diferentes, adequados às diversas espécies vegetais trabalhadas. A metodologia de isolamento de protoplastos compreende duas fases principais: digestão da parede e purificação da mistura obtida.
Explantes utilizados: segmento mesofiliar, calos friáveis e células em suspensão
Em condições normais, num meio hipotônico, a célula absorve água, o vacúolo aumenta mas ela não se rompe devido a parede. Isso não acontece com os protoplastos, sendo muito sensíveis a osmolaridade do meio. Portanto, deve-se trabalhar em meios hipertônicos durante td o processo de obtenção e isolamento.
A digestão da parede é feita por celulases, pectinases e hemicelulases. Submete-se o explante a solução enzimática e mantem-se sob agitação constante, em um meio ( Cpw ou MS) cujas condições são ótimas para atuação da enzima ( meio tamponado- Ex MES pH 5,5; 25-28º C). Utiliza-se sacarose e sais minerais para manutenção do meio hipertonico
Após um período de tempo, as substancias podem começar a serem absorvidas, devendo-se usar uma solução inerte, q não seja metabolizada pela célula ( manitol/sorbitol- na etapa de centrifugação, ajudarão na separação dos protoplastos).
Purificação
Centrifuga-se, e após a etapa de centrifugação, os debris celulares serão separados dos protoplastos ( o manitol ajuda na separação, por gerar uma densidade do meio propicia).Retira-se o sobrenadante e submete a uma solução de sacarose 22%. Centrifuga e os protoplastos formarão um anel acima do colchão de sacarose
Após a purificação, deve-se quantificar e fazer um teste de viabilidade desses protoplastos( deve-se usar rapidamente os mesmos, pois a síntese de parede pode iniciar). A quantificação pode ser feita em camara de neubauer. A viabilidade pode ser