Hplc

Cromatografia líquida
José Luiz da Costa [e-mail]

CLAE - HPLC
Método físico-químico que permite a separação de componentes de uma mistura, através da distribuição destes componentes em duas fases, que estão em contato íntimo.

Fase móvel
(amostra)

(Componentes retidos)

Fase estacionária

Migrações diferenciais

Analito

mov

Analito

est

K = Analitoest / Analitomov = coeficiente de partição

Instrumentação para HPLC

Instrumentação para HPLC

Reservatório para fase móvel

Bomba

Injetor

Sistema de Injeção

Fase estacionária
Fase ligada

Interações entre fase móvel e fase estacionária

Colunas para HPLC
60,0 (%) 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
-1 8 fe ni l N H FN de xt r R P R P in a 2 -8
20,0 57,0

5,7

2,9

5,7

2,9

2,9

2,9

tipo de coluna

Figura: colunas utilizadas para análise de preparações farmacêuticas segundo a USP XXV (n=35).

ci cl o

Detectores UV/Vis

UV/Vis - λ variável

Arranjo de diodos - DAD

• Comprimento de onda fixo
• Comprimento de onda variável • Arranjo de diodos

Comprimento de onda variável

Arranjo de diodos

Detector por arranjo de diodos

Fator de retenção ou capacidade

Fator de seletividade

Resolução ∆ tR Wm W1 + W2 2

Rs =

Wm =

Números de pratos - Eficiência

Assimetria do pico

Fator de assimetria =

CB AC

A

••

C

•

B
10% da altura do pico tempo

Parte Experimental Determinação de:
O NH S O O
Sacarina
O N CH3 O CH3 N CH3 N N

Cafeína

COOH
Ácido benzóico

Seqüência • Lavagem da coluna - MeOH por 30 minutos • Condicionamento da coluna com fase móvel • Monitoramento da linha de base • Injeção das amostras Experimento A • Injetar solução de cafeína (CF) • Injetar mistura (MX) Rs, N, H, k, assimetria • Injetar mistura + Spike de cafeína Identificação do pico da cafeína, comparar as técnicas de padrão externo e Spiking

Experimento B Adições de padrão

1mL H2O 3mL H2O 1mL Am