extração dna graos

Universidade Federal de Santa Catarina –

AULA PRÁTICA 1 - EXTRAÇÃO DNA
ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS
(MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE OGM)
1. Pesar 1 Kg de grãos;
2. Moer os grãos em moinho analítico e colher duas sub-amostras 100 mg de farinha em tubo de microcentrífuga de 2 mL;
3. Acrescentar 800 µL de tampão CTAB (CTAB 20 g/L, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH
8, 20 mM EDTA) e homogeneizar em vortex por 1 min;
4. Adicionar 20 µL de proteinase K (20mg/ ml) e homogeneizar manualmente suavemente. 5. Incubar a 65ºC por 15 min;
6. Adicionar 20 µL de RNAse A (10 mg/mL) e homogeneizar manualmente suavemente.
7. Incubar a 65ºC por 10 min;
8. Adicionar 520 µL clorofórmio
9. Agitar em um Vortex durante 1 min;
10. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
11. Transferir o sobrenadante (~500 µL) para um novo tubo (1,5 mL) e acrescentar igual volume (~500 µL) de clorofórmio
12. Agitar em um Vortex durante 1 min;
13. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
14. Transferir o sobrenadante (~500 µL) para um novo tubo (1,5 mL) e acrescentar igual volume (~500 µL) de isopropanol e ½ V (~250 µL) de acetato de amônio 7,5 M;
15. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
16. Retirar o sobrenadante e lavar o precipitado com ~500 µL de etanol 70%;
17. Centrifugar 13.000 rpm por 5 min;
18. Retirar o sobrenadante e secar o precipitado em temperatura ambiente durante 15 min;
19. Solubilizar o precipitado em 50 µL de água ultra-pura. Deixar a 4°C overnight
20. Determinar a concentração e qualidade do DNA em espectrofotômetro UV/Vis a 260 nm e 280 nm
21. Armazenar a solução de DNA a -20ºC.
TAMPÃO CTAB
P/ 100 mL pesar: 100 mM Tris pH 8,0------------1,21g
1,4 M NaCl----------------------8,18g
20 mM EDTA-------------------0,74g
2% CTAB-----------------------2,0g