Extracção de RNA – Método do Isotiocianato de Guanidina Análise de RNA por espectrofotometria e electroforese em gel de agarose

Extracção de RNA – Método do Isotiocianato de Guanidina
Análise de RNA por espectrofotometria e electroforese em gel de agarose
Ana Campos nº 37293 ; Carolina Collinge nº 38296; Tânia Santos nº 37352

Sinopseooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo- ooooooooooooo O método single step tornou-se muito utilizado para o isolamento e purificação de RNA intacto a partir de amostras biológicas de diferentes fontes. Esta técnica baseia-se em separar RNA do DNA e das proteínas após a adição de TRIzol, seguido de centrifugação. Deste modo, o RNA permanece na fase aquosa, é precipitado com isopropanol e tratado com DEPC.
Recorrendo a métodos electroforéticos, foi avaliada a integridade, quantidade e pureza do RNA extraído, tendo-se observado três bandas de rRNA (5S, 18S e 28S) e um smear (mRNA). Por outro lado, recorrendo a métodos espectrofotométricos, extraiu-se teoricamente 1702,4 µg/mL de RNA. Através das razões A260/A280 = 1,44 e A260/A230 = 0,33, conclui-se que a solução contendo RNA estava contaminada com proteínas e álcoois (isotiocianato de guanidina, contido no TRIzol e/ou isopropanol), respectivamente. Introduçãoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo- ooooooo Para efectuar estudos baseados em RNA é essencial obter esta molécula intacta, purificada e em elevada quantidade partindo de pequenas quantidades de tecido e células [1]. O método mais utilizado para extrair RNA foi desenvolvido por Chomczynski e Sacchi e requer tiocianato de guanidina, fenol e clorofórmio a pH ácido [6]. Este método designado por single step [3] permite separar o RNA do DNA e das proteínas após a adição de TRIzol (solução monofásica aquosa que contém fenol, isotiocianato de guanidina e clorofórmio) seguido de centrifugação [4;8]. De modo a evitar contaminações e inibir a acção de RNases, o material utilizado tem de ser esterilizado e as soluções tratadas com dietil pirocarbonato (DEPC) [5;8].
A pH ácido, o DNA e as proteínas