Extra o RNA Trizol

Extração RNA – Método Trizol
1. Colocar 1mL de trizol em cada eppendorf com as células (1mL de trizol para cada 50-100mg de tecido).
2. Montar o triturador e separar um tubo falcon 50mL com água DEPC para fazer a lavagem do triturador entre uma amostra e outra.
3. Deixar as amostras em temperatura ambiente por 5 min.
4. Fazer uma alíquota de clorofórmio e usar 200µL em cada amostra (Esta etapa tem que ser rápida devido a evaporação do clorofórmio).
5. Vortexar por 10segundos.
6. Deixar as amostras por 3min em temperatura ambiente.
7. Centrifugar a 12000G por 15min (colocar o “rabinho” do epperdorf para cima).
8. Tirar o sobrenadante (é o sobrenadante que interessa). Tirar em média 500 µL do sobrenadante e transferir para um outro eppendorf.
9. Adicionar 500 µL de isopropanol gelado (500 µL para cada mL de trizol). Agitar levemente.
10. Deixar encubar por 10min em temperatura ambiente.
11. Centrifugar a 12000G por 10min.
12. Tirar o sobrenadante com a bomba à vácuo ou pipeta (o pellet ficará do lado do “rabinho” do epperdorf ).
13. Adicionar 1mL de etanol 70% gelado. Homogeneizar levemente.
14. Centrifugar a 12000G por 10min.
15. Tirar o álcool (sobrenadante) com a bomba à vácuo ou pipeta (o álcool atrapalha a PCR).
16. Usar uma estante e deixar o eppendorf inclinado durante 10min. Dentro da geladeira para secar o álcool.
17. Ressuspender em 50 µL de água DEPC (30 µL se não visualizar o pellet).
18. Guardar a amostra no freezer.