Ensaio de luciferase

2.5.3 MATERIAIS
- Pipetas automáticas
- Placa de 96 poços
- Meio DMEM com 10% SFB
- Células da linhagem Jurkat transduzidas: Jurkat 4.30 NFAT WT Jurkat 4.30 NFAT 20BBζ
- Células da linhagem leucêmica K562: K562 WT K562-CD20
- Anticorpo monoclonal Rituximab®
- Agentes farmacológicos PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) e Ionomicina
- PBS
- Tampão de lise (PLB)
- Luciferina
- Placa de leitura
- Luminômetro

2.5.4 PROCEDIMENTOS
- Calcular o número total de células utilizadas no ensaio, obedecendo às seguintes condições:
Serão incubadas 1 x 105 células de cada tipo por poço, na razão de 1:1, em um volume final de 200μL. As condições deverão ser feitas em duplicata.
Observação:
As linhagens de linfócitos Jurkat incubadas na ausência das células-alvo K562 ou co-incubadas com as células K562 WT serão utilizadas como controle negativo experimento.
Os agentes farmacológicos PMA (20μM), que mimetiza a sinalização que ativa as vias de ativação como a PCK, e Ionomicina (1μM), que promove o aumento intracelular de cálcio, são capazes de induzir vários eventos bioquímicos, de maneira análoga à ativação da via de TCR. Portanto, serão utilizados como controle positivo do experimento.
As células Jurkat contendo o receptor quimérico serão incubadas com as células-alvo K562 que foram modificadas para expressar o respectivo ligante (no caso, a molécula CD20), para avaliar a ativação das Jurkat desencadeada pelo CAR.
O anticorpo Rituximab® na concentração 10μg/mL será utilizado para bloquear a molécula CD20 das células-alvo K562, 30 minutos antes da incubação com as linhagens de linfócitos Jurkat expressando o CAR.
- Incubar a placa de 96 poços com as células na estufa a 37oC contendo 5% CO2 durante 8 horas.
- Após incubação, transferir as células para tubos eppendorfs (lembrando de trocar a ponteira para cada condição) e centrifugar a 32000g por 30 segundos.
- Retirar o sobrenadante e lavar com 1mL de PBS 1x.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender o