determinação de actividade celulitica do DNSA numa amostra de alimento seco

Faculdade de Medicina Veterinária
Universidade de Lisboa
Disciplina de Nutrição Animal
3º Ano, 1º semestre
2014/2015

- Determinação da actividade celulolítica através da quantificação de açucares redutores – Método DNSA

Pretende-se quantificar a actividade celulolítica presente num extracto proteico previamento preparado. Uma quantidade definida de extracto proteico será incubada com o substrato solúvel a temperatura controlada. A acitividade celulolítica será determinada através da quantificação de açúcares redutores libertados durante o período de incubação.
Material:
- Solução de glucose a 1 mg/mL (para curva-padrão);
- Extracto proteico (previamente preparado);
- Substrato 1 % (carboximetilcelulose);
- Tampão fosfato-citrato (tampão PC);
- Reagente DNSA (1% ácido dinitrosalicilico, 0.2% fenol e 1% hidróxido de sódio) (para parar a reacção enzimática);
- Banho de água a 40ºC;
- Banho de água a 100ºC;
- Centrífuga;
- Tubos (em triplicado e para 2 pontos diferentes de tempo);
- Cronómetro;
- Gelo.

Método:
Curva-padrão:
1) Preparar tubos para quantificação de açúcares redutores (em duplicado e para
5 pontos de quantidade de glucose);
2) Adicionar quantidades crescentes de glucose e quantidades decrescentes de tampão PC nos respectivos tubos (até um volume total de 600 uL);

Tubos

Volume glucose (1

Volume tampão

mg/mL)

PC

1

0

600

2

100

500

3

200

400

4

300

300

5

400

200

6

500

100

7

600

0

3) Agitar vigorosamente;
4) Adicionar 600 uL de reagente DNSA;
5) Ferver durante 15 minutos e incubar em gelo durante 5 minutos;
6) Centrifugar durante 5 minutos a 11000 rpm;
7) Medir absorvância a 575 nm;
8) Desenhar curva-padrão (Absorvância vs quantidade de glucose em µmol)

Reacção:
1) Preparar tubos suficientes para avaliar actividade celulolítica de um extracto proteico, em função do tempo (10 e 20 minutos) e em triplicado. Pipetar 550 uL de
substrato