Cucu

Apontamentos Genética – 1º Teste

Aula nº1 – Extracção não enzimática de DNA de leucócitos a partir de sangue

Objectivo
 Extracção de DNA dos glóbulos brancos, a partir de sangue;
 Extracção é feita a partir de glóbulos brancos uma vez que glóbulos vermelhos adultos já não têm núcleo.

Reagentes utilizados
Tampão TKM-1
 Tris-HCl
- Tampão que mantém pH estável
 MgCl2
- Dissocia-se em co-iões
- Catiões aos grupos fosfatos protegendo a integridade do DNA
 EDTA
- Impede a acção das nucleases
- Agente quelante que se liga a iões que são cofactores das nucleases
- Anticoagulante do tipo não heparínico que inibe reacções enzimáticas
 KCl
- Dissocia-se em co-iões
- Catiões aos grupos fosfatos protegendo a integridade do DNA

Tampão TKM-2
Igual ao tampão anterior com a diferença de possuir NaCl
 Tris-HCl
 MgCl2
 EDTA
 KCl
 NaCl
- Prepara a amostra para o passo 13 (adição de NaCl saturado).

Tampão TKM X-100
 2,5% de Triton X-100 em tampão TKM-1
- Triton é um detergente
- Permite a lise das células para extracção de DNA

Tampão TE
Tampão de conservação
 Tris-HCl
- Tampão que mantém pH estável.

 EDTA
- Inactiva actividade das nucleases
- Agente quelante que se liga a iões que são cofactores das nucleases
- Anticoagulante do tipo não heparínico que inibe reacções enzimáticas
 Características do TE
- Conserva durante longos tempos;
- Se amostra não estiver pura  Conservar a -20ºC, no entanto o congelamento vai quebrar DNA;
- Se amostra estiver pura  Conservar a 4ºC

Igepal (Sigma)
 Detergente não iónico
 Provoca a lise celular das células

SDS a 10%
 Detergente iónico
 Desnatura e dissocia proteínas nucleares

NaCl saturado
 Separa as proteínas dos restantes constituintes

Etanol absoluto (-20ºC)
 Precipita o DNA

Protocolo Experimental
1)

Colher o sangue em tubos com anticoagulante EDTA;
- EDTA: Antiacoagulante não heparínico que inibe as reacções enzimáticas

2) Adicionar o