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Cromatografia de Exclusão Molecular

data: 2010-11-16 Turma: 2
Grupo :2 Índice
1. Resumo 3
2. Material e Métodos 4
2.1 Montagem da coluna 5
2.2 Aplicação do azul de dextrano 5
2.3 Aplicação das misturas padrão 6
2.4 Aplicação da amostra desconhecida 7
3. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados 8
2 Conclusão 16
3 Bibliografia 17
Anexos 18

1. Resumo

Este trabalho experimental teve como objectivo a ilustração da separação de uma mistura de proteínas globulares, recorrendo à cromatografia de exclusão molecular, também conhecida como filtração gel, determinando a massa molecular de uma proteína desconhecida, tendo por base o comportamento de uma amostra padrão.
Como se verifica em todas as técnicas cromatográficas, recorremos à utilização de uma fase estacionária, neste caso o gel Sephacryl S-200-HR, o qual apresenta uma gama de fraccionamento de 5000 a 250000 para proteínas globulares, e uma fase móvel, o tampão Tris-HCl (pH 8,2) 50mM com NaCl 100mM. A separação é feita consoante o raio efectivo das moléculas, o raio de Stokes, e a velocidade de migração das partículas é tanto menor quanto menor for o seu tamanho, devido a uma maior penetração na rede de poros que constitui a fase estacionária.
Inicialmente, para testar a homogeneidade do empacotamento da coluna e calcular o seu volume morto aplicou-se a amostra de azul de dextrano na coluna a um fluxo regulado a 1mL/min e deixou-se eluir com tampão Tris-HCl (pH 8,2) 50 mM com NaCl 100 mM, recolhendo se fracções de 1mL de eluído + 2mL de tampão que foram então estudadas qualitativamente (cor) e quantitativamente, através da leitura de Abs620nm, permitindo traçar o espectro de absorção do azul de dextrano, λ =[250,750] nm, O volume morto obtido foi de 11,5mL.
Em seguida, aplicou-se a mistura padrão, verificando-se que a albumina sérica bovina (BSA) elui primeiro, uma vez que tem maior massa molecular, 66 400 Da, penetrando menos no gel, seguindo-se a eluição da