Cristalografia de proteínas

Determinação da estrutura tridimensional de proteínas através da técnica de cristalografia por difração de raios X

Níveis de Estrutura Protéica

Estrutura Primária

Ligação peptídica

Ligação dissulfeto

As ligações peptídicas rígidas limitam o n de conformações que podem ser assumidas por uma cadeia polipeptídica

-hélices

Folhas-

Purificação de proteínas

Cromatografia em coluna:

• cromatografia de troca iônica
• cromatografia de exclusão por tamanho
• cromatografia de afinidade

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia de exclusão por tamanho

Cromatografia de afinidade

Eletroforese
• Estimativa da pureza da amostra e peso molecular protéico
• Gel de poliacrilamida
• Detergente SDS (dodecil sulfato de sódio)

Cristalização
Etapas:
•Nucleação
•Crescimento
•Cessação do crescimento.

Diagrama de fases

Fatores que alteram a solubilidade:

• Temperatura
• pH

• Sais (saltting in e saltting out)

Experimento de Cristalização

Método de difusão de vapor:

hanging drop

sitting drop

sandwich drop

Condições de cristalização
Na prática, várias possíveis combinações físicoquímicas são exploradas através do método de matriz esparsa:
• pH(tampões)

• aditivos
•agentes precipitantes (PEG, MPD,sais)

Otimização

Experimento de difração por raios X:

Padrão de difração

Densidade eletrônica

raios X

Estrutura tridimensional

A resolução da estrutura tridimensional de proteínas nos permite:
• Desenvolver compostos que inibam enzimas essenciais em organismos patológicas
• Elucidar mecanismos de resistência a drogas
• Propor relações evolutivas entre proteínas de diversos organismos Referências

•Lehninger, A. L.;Nelson, D. L.; Cox, M.M.,Princípios de bioquímica,
(tradução Arnaldo A. Simões) Savier, São Paulo, 2000.
•Drenth, J. Principles of Proteins X-Ray Crystallography.
Springer-Verlag. New York. USA. 1994.
•Ducruix, A. e Giegé, R.