bioqumica

Material
Solução 1% de amido solúvel;
Solução tampão 0,1Mol/L de diferentes valores;
Solução de alfa-amilase;
Solução de HCl 0,1 Mol/L;
Solução de Iodo-KI;
Água destilada;
Espectofômetro;

Métodos
a) Pipetamos 0,5mL de solução 1% de amido solúvel nos tubos numerados (pH2,6; pH3,0; etc) que continham 0,4 mL de solução de tampão 0,1 Mol/L de diferentes valores de pH.
b) Incubamos os tubos de ensaio durante 5 minutos a 50°C em banho de água termostatizado.
c) Adicionamos exatamente 0,1mL de solução de alfa-amilase nos tubos de ensaio contendo substrato em diferentes valores de pH diretamente sobre o substrato e incubamos os tubos de ensaio durante 5 minutos a 50°C.
d) Ápos a incubação adicionamos 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L nos tubos de ensaiopara paralisar a reação.
e) Adicionamos 0,1 mL de solução de Iodo-KI nos tubos de ensaio e completamos o volume para 15 mL com água destilada.
f) Preparamos o tubo “branco”. Pipetamos 0,1 mL de solução de iodo + 14,9mL de água destilada.
g) Preparamos o tubo “controle”, pipetando 0,5mL de solução 1% de amido solúvel +0,5 mL de água destilada + 0,1 mL de solução de Iodo-KI + 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L em tubo de ensaio numerado. Completamos o volume para 15 mL com água destilada.
h) Calibramos o espectrofotômetro, ajustando o zero de absorbância com a solução de tubo “branco” e medir a absorbância das amostras dos tubos teste e “controle” a 620nm.
i) Calculo dos valores da atividade de alfa-amilaze (U/mL de enzima comercial):

Abs 620nm do tubo controle - Abs 620nm de uma das diferentes soluções tampão= x

1U---------0,001 y-----------x => y=zU

zU------------5min w-------------1min => h=wU/min

wU/min----------0,1mL z-------------------1mL => zU/min*mL

zU/min*mL = Unidade de Atividade de alfa-amilase

Resultados e discussões Gráfico 1: Atividade Relativa x pH

Os resultados obtidos nesse experimento (gráfico 1) mostram