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SEQÜENCIAMENTO DE DNA Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila/apost9.htm
1. Sequenciamento manual
O método de sequenciamento do DNA mais utilizado no momento foi desenvolvido por Sanger e colaboradores (1979), conhecido também como método do término do crescimento da cadeia.
O sequenciamento do DNA através deste método, exige a clonagem do fragmento de DNA e de seus subfragmentos a serem sequenciados em vetores apropriados como os da série M13mp os quais tem sido largamente utilizados para esta finalidade.
O príncipio do método baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar uma fita de DNA a partir do molde na presença de um iniciador. A reação de sequenciamento consiste na hibridização de um oligonucleotídeo sintético (iniciador), com uma região conhecida do vetor (M13), imediatamente adjacente ao inserto a ser sequenciado.
A seguir, promove-se a síntese da fita complementar empregando o fragmento Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de deoxinucleotídeos (dNTP), sendo um deles marcado com 32P ou 35S.
No processo são realizadas quatro reações independentes, sendo que em cada uma delas é adicionado um tipo de dideoxinucleotídeo (ddNTP). Em cada reação, um número muito grande de moléculas de fita complementar estão sendo copiadas simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extensão, uma pequena porcentagem de moléculas irá incorporar um ddNTP e neste caso a reação de alongamento da cadeia será automaticamente interrompida naquele sítio, devido à ausência do grupamento 3'OH do ddNTP. Por outro lado, em outras moléculas a reação de extensão continua a ocorrer até que um ddNTP seja incorporado.
Sendo assim, em cada uma das quatro reações, haverá fragmentos de todos os tamanhos sendo que todos eles tem início comum ou seja adjacente ao iniciador.
Uma vez terminadas as reações de extensão, cada fragmento recém sintetizado é separado em gel desnaturante de poliacrilamida-uréia e a seguir autoradiografado. Como este tipo de gel tem alto